<<
>>

Оценка цитотоксической активности с использованием проточной цитометрии

Кроме описанного «хромового» теста, существуют методики оценки клеточной цитотоксичности с использованием проточного цитофлуориметра. В данном случае для мечения клеток используют два реагента.

Сначала метят КМ флуорохромом, который проникает в клетки, не повреждая их, и флуоресцирует, возбужденный лазерным излучением. Затем к КМ добавляют КЭ, инкубируют их совместно, чтобы дать возможность реализоваться киллерной атаке, и добавляют к смеси второй реагент, превращающийся во флуорохром только в живых клетках под действием их ферментов-эстераз. В результате в итоговой картине КЭ станут светиться одним цветом «живого флуо- рохрома», живые КМ будут двухцветными, погибшие КМ — одноцветными по первому флуорохрому.

Известен метод оценки антителозависимой клеточной цитотоксичности с использованием в качестве КМ эритроцитов (например, барана), покрытых IgG- антителами к ним. КЭ, несущие Fc-рецепторы к IgG, разрушают (лизируют) КМ, и по уровню освобождаемого в культуральную среду гемоглобина судят об активности таких киллеров (NK, В-клетки, моноциты, макрофаги и др.).

Рис.
1.1. Мышь линии CBA/J
Рис. 1.2. Мышь линии C57B1/6J

Рис. 1.6. Мышь линии Nude
Рис.
1.7. Мышь линии AKR/J

Плазма

Кольцо _ монону- клеарных клеток

- Эритроциты

Фиколл-урографин

р=1,077

Рис. 2.2. Выделение мононуклеарных клеток в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина

Плазма

Кольцо

монону

клеарных

клеток

Кольцо

нейтрофилов

Рис. 2.3. Выделение нейтрофилов в двухступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина

Переднее рассеяние

Рис. 2.6. Проточный цитофлуориметр

colspan=5>
1.
Инкубация мононуклеарных клеток с магнитными микробусами нагруженными антителами
Происходит связывание магнитных микробус с целевыми клетками
2. Пробирка с клетками помещается в магнитное поле для разделения связавшихся с микробусами клеток
3. Для отделения клеток от микробус добавляют специальный буфер. Пробирку помещают в магнитное поле и клетки, открепившиеся от микробус, отбирают и помещают в отдельную пробирку
Бусина
Стрепт^* , авидин і Биотин Клетка j

« с

Ж; ;

Буфер
Суспензия выделенных клеток
а

Рис. 2.8. Иммуномагнитная сепарация: а — основные этапы; б — магнитные бусы; в — пример магнитного штатива

Рис.

3.1. Тетрамерные структуры: а — строение тетрамерной структуры; б — связывание тетрамера ЦТЛ; в — пример результатов, полученных при анализе тетрамерных структур на проточном цитофлуориметре; ФИТЦ — флуоресцеин-5-изотиоционат; ФЭ — фикоэритрин

Выделение лимфоцитов из крови на градиенте плотности (фиколл-гепак)
Кольцо из лимфоцитов между плазмой и градиентом
Жизнеспособные лимфоциты (неокрашенные клетки)
Лимфоциты + типирующие антитела + комплемент. Инкубация
Определение жизнеспособности лимфоцитов с раствором трипанового синего
Если убито около 90% лимфоцитов (окрашенные клетки) то тест положителен на антиген HLA класса I
Рис. 3.2. Микролимфоцитотоксический тест (серотипирование HLA класса I)

Рис. 3.3.

Фагоцитоз зимозана макрофагом (конфокальная микроскопия и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия): а — интактный макрофаг; б — макрофаг, захвативший зимозан (красный)

Рис. 3.6. Непрямой метод Йерне: а — схема постановки метода; б — зона гемолиза, в центре АОК

—о —

СВА Получение

иммунокомпетентных

клеток

о
Перенос клеток в сингенного, летального

облученного реципиента

Методы учета: иммунологические; гистологические; цитологические

Рис.

4.1. Метод Оухтерлони и Элека: а — линии преципитации, при диффузии двух одинаковых антигенов (АГ) навстречу антителам (АТ), плавно сливающиеся друг с другом; б — линии преципитации, при диффузии двух разных антигенов навстречу антителам, не сливающиеся, а пересекающиеся между собой, «не замечающие» друг друга

colspan=2 align=left>

Рис. 4.7. Планшет с результатами ИФА

Рис. 4.12. Общий принцип метода ELISPOT для определения количества клеток, секретирующих цитокины. Красными треугольниками обозначены секретируемые цитокины

Рис. 6.9. Оборудование для приготовления микрочипов: механический робот для нанесения через игольчатые растры проб на поверхность стекол (а); сканер для детекции интенсивности флюоресценции в ячейках (б); данные со сканера передаются на персональный компьютер для дальнейшей обработки

д

Сигналы от различно экспрессируемых генов

Слабая экспрессия генов

Одинаковая экспрессия генов

ИЛ-2

ФИО

/■

/

ИФНу'"

Рис. 7.3. Спектр цитокинов, секретируемых ТЫ- и ТЬ2-клетками

т
Повторы, богатые лейцином
TLR I

Активация адаптивного иммунного ответа ИНФо/р

ИНФ-индубельные гены

Рис. 7.4. TLR-опосредованная индукция выработки цитокинов клетками врожденного иммунитета

Здоровая

клетка

Инфицированная

клетка

ФИО
ФИО
ФНО-рецептор
TRADD
FADD
RIP-1
Активация апоптоза через каскад каспаз
Активация

МАР-киназ

Рис. 7.5. Передача сигнала с ФНО-рецептора

Рис. 7.6. Jak-STAT — сигнальный путь с цитокиновых рецепторов типа 1

<< | >>
Источник: Ковальчука, Г. А. Игнатьевой, Л. В. Ганковской. Иммунология : практикум : учеб, пособие. — М.: ГЭОТАР- Медиа,2010. 2010

Еще по теме Оценка цитотоксической активности с использованием проточной цитометрии:

  1. Оценка функциональной активности NK-клеток с использованием проточной цитометрии
  2. Применение метода проточной цитометри
  3. Выделение клеток методом проточной цитометрии
  4. Количественное определение субпопуляций лимфоцитов с помощью проточной лазерной цитометриис использованием моноклональных антител
  5. Определение цитотоксической активности NK-клеток
  6. Метод оценки хемотаксиса нейтрофилов с использованием камеры Бойдена
  7. ОЦЕНКА ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ
  8. ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТОВ
  9. Лабораторная работа 3-4 Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов человека
  10. ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА
  11. Харольд Стерн. Кушетка. Ее использование и значение в психотерапии.Перевод с английского Е. Замфир (Кушетка. Ее использование и значение в психотерапии) и О. Лежниной (Введение в современный психоанализ и работы Хаймана Спотница); при участии Т. Рудаковой. Научная редакция проф. М. Решетникова.2002, 2002
  12. ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ
  13. Оценка и калькуляция