<<
>>

Определение содержания NO в супернатантах культуры фагоцитов in vitro

Оксид азота (N0) участвует во многих физиологических и патологических процессах на уровне как клеток, так и организма в целом, выполняя защитное, регуляторное и повреждающее действия.

Регуляторное действие N0 проявляется в поддержании тонуса и проницаемости сосудов, в подавлении адгезии тромбоцитов, в модуляции клеточной адгезии, нейротрансмиссии и бронходилатации, а также некоторых функций почек и иммунной системы.

Повреждающее действие оксида азота реализуется через ингибирование ферментативных функций, индукцию процессов перекис- ного окисления липидов и повреждения ДНК клетки, повышение чувствительности клетки к воздействию радиации, алкилирующих агентов и токсических металлов, а также через истощение анти- окислительных возможностей клетки. Непрямое цитотоксическое действие N0 осуществляется за счет модуляции цитокинового равновесия и опосредованной (через ИЛ-12) активации NK-клеток и цитотоксических лимфоцитов. Сам по себе N0 не является мощным цитотоксическим агентом, но может усиливать чувствительность клеток к действию других цитотоксических агентов.

Наиболее выраженной антимикробной активностью обладают соединения, образовавшиеся при взаимодействии АФК и N0 в случае их совместной генерации. В результате взаимодействия N0 с АФК и с некоторыми другими соединениями образуются цитотоксические агенты, в том числе пероксинитрит (0N00), S-нитрозотиолы (RSNO), нитроген- диоксид (N02), динитрогентриоксид (N203), динитроген-тетраоксид (N204) и железодинитрозильные комплексы (DNIC). Однако N0 может снижать эффективность окислительного взрыва за счет формирования железонитрильных комплексов, что уменьшает способность железа катализировать прооксидантные реакции.

Эффекты N0 принято разделять на основные и опосредованные. Основные включают те реакции, в которых он непосредственно взаимодействует со специфическими биологическими молекулами, например с гуанилатциклазой, цитохромом Р450 и др.

Опосредованные эффекты связаны не с самим N0, а с реактивными формами азота, образующимися при взаимодействии N0 с кислородом или с супероксидным анионом-радикалом.

Основные эффекты N0 имеют место при низких концентрациях N0 (менее 1 мкМ), тогда как побочные (включая образование радикалов) становятся возможными при более высоких концентрациях N0 (более 1мкМ).

Оксид азота in vivo образуется с участием NO-синтазы (NOS), которая у млекопитающих существует в трех изоформах: nNOS — нейтральная (тип 1); iNOS — индуцибельная (тип 2); ecNO-синтаза — эндотелиальная (тип 3).

В макрофагальных клетках функционирует iNOS, экспрессию которой стимулируют некоторые цитокины и микробные продукты, часто действующие в синергизме. NOS типов 1 и 3 называют также cNOS — избирательная, которая присутствует в клетках и может быть активирована притоком кальция с последующим его связыванием с кальмодулином. В присутствии iNOS оксид азота вырабатывается в больших количествах и часто дает побочные эффекты, такие, как перекисное окисление липидов и гидроксилирование, образование нитрозаминов и нитротирозина.

Активированный на цитохроме р450 кислород включается в реакцию образования NW-OH-L-аргинина и является участником одного из наиболее важных этапов в зависимой от NOS-реакции — окислении гуанидинового азота. Затем гидроксилированная форма L-аргинина при участии супероксидных анион-радикалов и гема превращается в L-цитруллин с одновременным образованием N0.

Для оценки продукции N0 перитонеальными макрофагами животных или моноцитами периферической крови человека определяют содержание нитрит-аниона (NO2-) в супернатанте культивируемых клеток (см. Лабораторную работу 3-5) спектрофотометрическим методом с использованием реактива Грисса. Для этого 150 мкл культуральной среды переносят из лунки планшета в пробирку и добавляют последовательно 75 мкл 1,5% раствора сульфаниламида и IN НС1 и 75 мкл 0,15% раствора нафтилэтилендиамминдихлорида в дистиллированной воде (компоненты реактива Грисса). Затем доводят объем раствора до 1 мл. После инкубации в течение 10 мин анализируют оптическую плотность раствора на спектрофотометре (например, на СФ-46) при 540 нм, используя в качестве контроля полную среду культивирования с добавлением раствора Грисса. Продукцию N0 выражают в микромолях при помощи калибровочного графика.

<< | >>
Источник: Ковальчука, Г. А. Игнатьевой, Л. В. Ганковской. Иммунология : практикум : учеб, пособие. — М.: ГЭОТАР- Медиа,2010. 2010

Еще по теме Определение содержания NO в супернатантах культуры фагоцитов in vitro:

  1. ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТОВ
  2. Оценка киллинга фагоцитов
  3. ГЛАВА З МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ IN VITRO И IN VIVO
  4. Лабораторная работа 3-5 Получение супернатанта, содержащего цитокины и другие биологически активные молекулы из моноцитов периферической крови человека
  5. Особенности постановки методов оценки хемотаксиса in vitro
  6. СОДЕРЖАНИЕ
  7. СОДЕРЖАНИЕ
  8. КУЛЬТУРА НАСИЛИЯ
  9. Физическая культура.
  10. Культура флэта
  11. Содержание занятий
  12. Содержание занятий
  13. Культура наших предков
  14. Молоко с пониженным содержанием жира
  15. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ТЕРМИНОВ И ИХ СОДЕРЖАНИЕ