ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК, СЕКРЕТИРУЮЩИХ ТОТ ИЛИ ИНОЙ ПРОДУКТ, - МЕТОД ELISPOT

Метод ELISPOT {Enzyme-linked immunospot, spot — пятно) был разработан в 1983 г. двумя группами авторов (Sedgwick J.D., Holt P.G., Czerkinsky С.С. et al.) для подсчета числа антителообразующих клеток.

Идея метода ELISPOT состоит в использовании культуры клеток in vitro при проведении ловушечного твердофазного иммуноанализа на пористой поверхности (рис. 4.12, см. также цв. вклейку). В настоящее время промышленность выпускает планшеты для культивирования (чаще всего 96-луночные, той же стандартной формы, что и планшеты для ИФА), дно которых покрыто нитроцеллюлозной мембраной. На нитроцеллюлозе сорбируют интересующий антиген, после чего в лунки помещают лимфоциты в полноценной культуральной среде и культивируют их в оптимальных для живых клеток условиях (С02-инкубатор, оптимальная плотность посадки клеток, все необходимые метаболические добавки и т.д.). Через несколько часов или

1, 2, 3 сут (условия подбирают опытным путем) клетки тщательно вымывают из лунок в проточной системе физраствором или водой с детергентом (например, 0,1% Tween-20 или др.).

Если какие-то клетки секретировали антитела против антигена, сорбированного на дне, то на этом дне фиксируются иммунные комплексы «антиген—антитело». Затем добавляют антииммуноглобулино- вый конъюгат с ферментом, инкубируют, промывают, добавляют бесцветный субстрат.

Вскоре стало очевидно: метод ELISPOT весьма универсален и пригоден для под

счета, скажем, клеток, продуцирующих тот или иной цитокин. В данном случае первым слоем на дно специальных планшетов для ELISPOT сорбируют моноклональные антитела против интересующего цитокина. Затем помещают в лунки культуру исследуемых клеток. Специфическим и творческим моментом в данном случае является добавление в культуру стимуляторов продукции заданного цитокина. Дальнейшие этапы выполнения метода те же, что при подсчете АОК.

Метод ELISPOT, несмотря на весьма высокие цены на реагенты и приборы, включен в международные протоколы обязательных исследований при разработках и клинических испытаниях вакцин. Мы приведем в качестве примера более подробный протокол методики с применением для повышения чувствительности авидин-биотиновой системы. Методика в целом включает два этапа:

1-й — стерильное культивирование живых и функционирующих

клеток;

2-й — иммуноанализ в тех же планшетах, но уже в нестерильных условиях.

Стерильные условия работы

1. Антицитокиновое антитело-1 сорбируют на пористой твердой фазе культурального планшета (это антитело — ловушка для секре- тируемого цитокина).

2. В планшет помещают исследуемые клетки (суспензию в различных концентрациях — от 105 до 2х106 в 1 мл).

3. К клеткам добавляют стимулятор в различных концентрациях.

4. Систему культивируют в оптимальных условиях в течение 2—24 ч или больше (подбирают оптимум).

Нестерильные условия работы

1. Лунки тщательно промывают сначала водой с целью удаления клеток, затем отмывочным буфером с детергентом (0,1% Tween-20), чтобы смыть все, что плохо связалось.

2. В лунки вносят конъюгат проявляющего антитела-2 с биотином, инкубируют 2 ч.

3. Промывают и вносят конъюгат «авидин—пероксидаза», инкубируют 1 ч.

4. Промывают и вносят субстратную смесь — АЕС [З-амино-9- этилкарбазол, растворенный исходно в М,]ЧГ-диметилформамиде (100 мг АЕС на 10 мл DMF) и разбавленный до конечной концентрации в 0,1 М ацетатном буфере, pH 5 и плюс перекись водорода; рецепт субстратной смеси: 333,3 мкл матричного раствора АЕС + 10 мл ацетатного буфера + 5 мкл 30% перекиси водорода].

5. Реакцию останавливают под визуальным контролем через 5—50 мин путем промывки плэйтов водой.

6. Плэйты сушат при комнатной температуре в темноте в течение 2 ч.

7. Регистрируют результат, т.е. подсчитывают пятна: либо «вручную», под соответствующим микроскопом (результаты получают в «двоичной системе» — «много» или «мало»), либо в специальном аппарате, считывающем картину дна лунок видеокамерой и соответствующей компьютерной программой анализа пятен (получают цифровой результат).

Результаты, получаемые в ELISPOT, отражены на рис. 4.13 (см. также цв. вклейку).

Рис. 4.13. Примеры результатов ELISPOT: увеличенное изображение двух лунок: лунки с положительным результатом (а), с четко различимыми «пятнами», подлежащими подсчету; лунки с отрицательным результатом (б)