<<
>>

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ И ЯДЕРНЫХ БЕЛКОВ - ФАКТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ, СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ И ДРУГИХ

Методы твердофазных иммуноанализов типа ELISA используют и для изучения молекулярных процессов проведения сигналов от мембранных рецепторов внутрь клетки. Эксперименты такого типа состоят из двух этапов.

Творческий поисковый этап — создание модели активации определенных живых клеток in vivo или в культуре in vitro.

Технический этап:

а) лизис клеток без денатурации макромолекул;

б) детекция искомых молекул передачи сигналов методом лову- шечного ИФА.

В качестве «ловушки» на твердой фазе используют высокоспецифичные антитела к определенным эпитопам, характерным для активированного состояния молекул, например сайтам фосфорилирования конкретных белков, участвующих в проведении сигнала. В этой связи коммерческие тест-системы такого назначения получили название «phosphoELISA».

Внутриклеточные белки исследуют в целях анализа конкретных молекулярных путей проведения сигналов в клетке (англ, pathways — путь), определяя конкретные киназы, фосфатазы, адаптерные белки, факторы транскрипции и др.

Для исследования внутриклеточных цитоплазматических белков и их производных интересующие клетки тщательно отмывают от внеклеточных субстанций 2—3-кратным центрифугированием (800 g, 5—6 мин) в фосфатном солевом буферном растворе, после чего лизируют буфером следующего состава (одного из возможных): 50 шМ Tris, pH 7,4; 250 mM NaCl; 5 mM EDTA (этилендиаминте- траацетат); 1% NP40 (Nonidet Р40); 50 mM NaF; ImM Na3V04; 1 mM PMSF (ингибитор сериновых протеаз — трипсина и химотрипсина — фенилметан-сульфонил флюорид, матричный 0,3 М раствор в ДМСО, добавляют ex temporo); смесь ингибиторов протеаз (AEBSF, пепста- тин А, Е-64, бестатин, лейпептин, апротинин или других, добавляют ex temporo).

Осадок отмытых фосфатным буфером клеток ресуспендируют в лизирующем буфере и оставляют на 15 мин в условиях мягкого перемешивания. Затем лизат центрифугируют при 14 000 об/мин в течение 10 мин, разливают по аликвотам, определяют в нем общую концентрацию белков (чаще всего — методом Bradford). Наиболее приемлемы для дальнейших анализов концентрации белков 200— 400 мкг/мл.

В дальнейшем выполняют обычный ловушечный вариант ELISA (см. выше). Весьма важен как можно более многосторонний контроль (как минимум заведомо положительный контроль, заведомо отрицательный контроль, а также лизат одноименных, но неактивированных клеток, лизат клеток, обработанных «посторонним» биохимически родственным активатору веществом и др.).

<< | >>
Источник: Ковальчука, Г. А. Игнатьевой, Л. В. Ганковской. Иммунология : практикум : учеб, пособие. — М.: ГЭОТАР- Медиа,2010. 2010

Еще по теме МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ И ЯДЕРНЫХ БЕЛКОВ - ФАКТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ, СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ И ДРУГИХ:

  1. Определение факторов транскрипции во внутриядерном содержимом
  2. Методы исследования иммунной системы
  3. Методы исследования
  4. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ ДЫХАНИЯ
  5. Распространенные методы исследований
  6. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ МЕТОДОМ МИКРОЧИПОВ
  7. ГЛАВА 6 ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ИММУНОЛОГИИ
  8. Дополнительные методы исследования
  9. ДОПОЛНЕНИЕ: К МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ
  10. ДОПОЛНЕНИЕ: К МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ
  11. Статические методы исследований
  12. Субъективные методы исследования