<<
>>

Лабораторная работа 2-2 Постановка метода Рекалде

1. Кровь осторожно перемешивают с 6% раствором декстрана Т-500 («Pharmacia», Швеция), приготовленном на физиологическом растворе из расчета: 1 объем декстрана на 5 объемов крови.

2. Кровь отстаивается в течение 30 мин (15 мин при 37 °С, затем 15 мин при комнатной температуре).

3. Осторожно собирают плазму, обогащенную лейкоцитами (лей- комасса). К полученной лейкомассе трехкратно добавляют раствор NaCl по следующей схеме:

• 0 мин — добавляют 9% NaCl из расчета 5 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37 °С;

• 11-я минута — добавляют 9% NaCl из расчета 10 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37° С;

• 21-я минута — добавляют 9% NaCl из расчета 10 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37 °С.

Общее время инкубации составляет 30 мин.

4. К лейкомассе добавляют равный объем раствора Хенкса, соответствующей осмомолярности, полученный путем добавления 25 мкл 9% раствора NaCl на каждый миллилитр стандартного раствора Хенкса.

5. Немедленно проводят выделение моноцитов на гипертоническом градиенте плотности. Для этого в стандартный раствор фиколл- урографина добавляют кристаллический NaCl из расчета 2,8 мг на каждый миллилитр раствора фиколл-урографина (удельная плотность 1,078 г/см3).

Конечная плотность раствора составляет 1,080 г/см3. В силиконированные пробирки на один объем гипертонического градиента осторожно наслаивают 3 объема подготовленной лейкомассы.

6. Пробирки центрифугируют в течение 25 мин при 400 g при комнатной температуре в центрифуге с горизонтальным ротором. После центрифугирования моноциты концентрируются в интерфазном кольце.

7. Моноциты из интерфазы переносят в силиконированные пробирки и дважды отмывают средой 199, содержащей 5% СЭК. Режим центрифугирования — 10 мин при 200 g.

8. Клетки ресуспендируют в питательной среде RPMI-1640, содержащей 1% L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина и 10% СЭК. Количество моноцитов определяют подсчетом в камере Горяева. Жизнеспособность клеток оценивают с помощью 0,1% раствора три- панового синего.

<< | >>
Источник: Ковальчука, Г. А. Игнатьевой, Л. В. Ганковской. Иммунология : практикум : учеб, пособие. — М.: ГЭОТАР- Медиа,2010. 2010

Еще по теме Лабораторная работа 2-2 Постановка метода Рекалде:

  1. Лабораторная работа 4-1 Определение уровня IgM, IgA и IgG в сыворотке человека методом радиальной иммунодиффузии
  2. Особенности постановки методов оценки хемотаксиса in vitro
  3. Постановка реакции выявления АОК (метод Н. Йерне)
  4. Лабораторная работа 2-1
  5. Лабораторная работа 2-3
  6. Лабораторная работа 3-1
  7. Лабораторная работа 3-2
  8. Лабораторная работа 7-2 Определение активности интерферона
  9. Лабораторная работа 7-3 Определение МИФ-активности
  10. Лабораторная работа 3-4 Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов человека
  11. Лабораторная работа 4-2 Твердофазный непрямой иммуноферментный анализ