<<
>>

Бактерицидный проницаемость увеличивающий белок

Поиски антимикробных факторов нейтрофилов, избирательно действующих на грамотрицательные бактерии, были стимулированы наблюдениями (Elsbach, 1980), установившими различный характер ультраструктурных изменений фагоцитированных бактерий в зависимости от особенностей строения их клеточной оболочки.

Так, если поглощение и инактивация грамположитель- ных бактерий сопровождались быстрыми и обширными деструктивными изменениями микробных клеток, то начальные стадии фагоцитоза кишечной палочки протекали без ее существенной структурно-функциональной дезорганизации.

В серии работ (Weiss et al., 1975, 1978) было осуществлено выделение лизин-богатых белков из нейтрофилов человека и кролика с молекулярной массой в пределах 50—60 кДа, которые в условиях in vitro оказывали цитоцидное действие преимущественно на грамотрицательные виды бактерий. Установленная способность этих белков подавлять деление и увеличивать проницаемость наружной мембраны бактерий послужила основанием для наименования их как бактерицидные проницаемость увеличивающие белки (БПУ-белки).

БПУ-белки составляют до 1 % от общего белка нейтрофилов человека и кролика и содержатся в азурофильных гранулах. Клонирование генов и воссоздание на основе генной структуры аминокислотной последовательности белков из нейтрофилов человека и крупного рогатого скота (рис. 22) выявило значительную степень сходства их первичных структур (> 60 %) (Gray et al., 1989; Leong, Camerata, 1990; Elsbach, Weiss, 1993a, 1993b). Изоточки обоих белков находятся в щелочной области значений pH (р1~9.5), что позволяет отнести их к поликатионным веществам. Другой отличительной особенностью этих белков является высокое содержание в их составе гидрофобных аминокислот (46 мол %). Белки состоят из катионной, лизинобогащенной N- концевой части и очень гидрофобной слабо заряженной С-кон- цевой половины.

Относительно гидрофильный пролин-богатый участок, чувствительный к действию протеаз, разделяет эти две основные части молекулы БПУ-белка. После ограниченного протеолиза молекулы белка из него образуются 25 кДа аминотерминальный и 30 кДа карбокситерминальный фрагменты.

Холобелок в наномолярных (Weiss et al., 1978) концентрациях ингибирует рост и размножение многих видов грамотрица- тельных бактерий и не оказывает цитотоксического действия на грамположительные бактерии и эукариотические клетки.

Цитотоксическое действие БПУ-белка на грамотрицательные бактерии реализуется в две стадии. На первой стадии белки в концентрации 10-8—10~9 М при нейтрально-щелочных значениях pH вызывают в течение первых минут контакта с чувствительными бактериями (£. coli, S. typhimurium) обратимое подавление способности микробов к размножению (Weiss et al., 1978; Mannion et al., 1990a). Это явление совпадает по времени со связыванием белка с наружной мембраной и сопровождается временным увеличением проницаемости внешней (наружной) мембраны грамотрицательных бактерий для гидрофобных антибиотиков (актиномицин Д, рифампицин), в норме не проникающих в клетку, и активацией катаболических ферментов (фосфолипазы А2, пептидогликаназ) микробной стенки. Интересно, что, несмотря на потерю микроорганизмами способности к делению, некоторые их физиологические функции, связанные с деятельностью внутренней (плазматической) мембраны (транспорт ионов К+, макромолекулярные синтезы), остаются неизменными на протя-

л

FKIKHLGKGH

SGNFDLSIEG

KIESALRNKM

DVQMKGEFYS

RDDMIPKESK

VQAFAVLPNS

LQDIMNYIVP

Б

FKIKYLGKGQ

GGNFDLSVEG

RIESLLQKSM

DWLLKGEFFS

RDDMIPKESK

TQAFAILPNS

LQSVINYVMP

YSFYSMDIRE

MSISADLKLG

NSQVCEKVTN

ENHHNPPPFA

FRLTTKFFGT

SLASLFLIGM

ILVLPRVNEK

YSFFSMVIQG

ISILAGLNLG

TRKICEWTS

LAHRSPPPFA

FRLTTKFFGI

SLDPLFLLEM

TIVLPVINKK 1VNPGVWRIS

FQLPSSQISM

SNPTSGKPTI

SVSSKLQPYF

PPVMEFPAAH

FLPEVAKKFP

HTTGSMEVSA

LQKGFPLPTP

XTNPGIVARIT

FNLPNSQIRP

YDPASGHSTV

TVSSKLQPYF

PPALAFPSDH

LIPQVAKMFP

NLNLSVWGA

LQKGFPLPLP

QKGLDYASQQ

VPNVGLKFSI

TCSSCSSHIN

QTLPVMTKID

DRMVYLGLSD

NMKIQIHVSA

ESNRLVGELK

ARVQLYNWL

QKGLDYACQQ

LPDKGLDLSI

TCSSCSSGIN

QTLPVTTKLD

DRMVYLGISE

DMQMQLFIWA

KSDRLIGELR

AYIELFNLTL

GTAALQKELK

SNANIKISGK

SVHVHISKSK

SVAGINYGLV

YFFNTAGLVY

STPPHLSVQP

LDRLLLELKH

QPHQNFLLFG

GVLTLQKELE

RDASIKIRGK

TVRIHISGSS

KVAGVDYSLV

YFFNTAGFVY

SLPPKLTMKP

LDKLLLELKH

OPYQDFLLFG

RIKIPDYSDS

WKAQKRFLKM

VGWLIQLFHK

APPATTAETL

QEAGVLKMTL

TGLTFYPAVD

SNIGPFPVEL

ADWYK

KITIPNFSGN

WKARKNFIKL

LGWLIQLFRK

APPRATANNL

QKAGALNLTL

SSLDLIFVLD

SDIGPFSVES

ADVQYS

Рис.

22. Первичная структура бактерицидных проницаемость увеличивающих белков из нейтрофилов человека (А) и крупно- го рогатого скота (Б).

жении первых 20—30 мин взаимодействия бактерицидного белка с микробной поверхностью. Электронно-микроскопическое изучение морфологических изменений в обработанных БПУ-белком микробных клетках выявило только незначительное утолщение их наружной мембраны при практически полной сохранности внутренних структур бактерий.

Как было установлено в специально проведенном исследовании, первостепенное значение в реализации антимикробных свойств БПУ-белка имеет N-концевой фрагмент его молекулы (Ooi et аІ., 1991). Полученный путем протеолиза или биотехнологически рекомбинантный аминотерминальный фрагмент проявляет те же антибактериальные свойства, что и холобелок (Ooi et al., 1987; Weiss et al., 1992). Карбокситерминальный фрагмент не проявляет существенных антимикробных свойств.

N-концевая часть молекулы с молекулярной массой около 25 кДа характеризуется высоким положительным зарядом (+16) и гидрофобностью, обеспечивающими повышенное сродство белка к липополисахариду (эндотоксину) наружной мембраны грамотрицательных бактерий (Gazzano-Santoro et al., 1992). Очищенные природные и рекомбинантные (гВР155) холобелки, как и их аминотерминальные фрагменты (пВР125, гВР123) в условиях in vitro и in vivo ингибируют основные ЛПС-опосре- дованные эффекты (Ooi et al., 1987, 1991) благодаря их высокой эндотоксинсвязывающей способности. Неспецифическое электростатическое (заряд—заряд) взаимодействие основных групп (е-ЫН2-лизина, гуанидиновая аргинина) белка с кислотными компонентами (в первую очередь, по-видимому, с 3-дезокси- D-маннооктулозоновой кислотой) липополисахарида внешней мембраны грамотрицательных бактерий является первым необходимым условием реализации конечного биологического эффекта. Надфизиологические (40—80 тМ) концентрации Mg2+ или Са2+, препятствующие связыванию белка с поверхностью бактерий, блокируют и проявление его антимикробных свойств.

Интересно, что резистентные к действию БПУ-белка штаммы грамотрицательных (S. marcescens, Р. vulgaris) и грамполо- жительных бактерий не способны адсорбировать его на своей поверхности (Elsbach, Weiss, 1983, 1988). Чувствительность различных штаммов и видов грамотрицательных бактерий находится в прямой зависимости от степени сорбции на них бактерицидного белка. Шероховатые штаммы S. typhimurium и

Е. coli, несущие на своей поверхности больше анионных групп по сравнению с гладкими штаммами, связывают БПУ-белок из среды эффективнее, они и более подвержены его антимикробному действию. Можно отметить, что активности холобелка и его аминотерминального фрагмента в отношении шероховатых штаммов практически одинаковы, но рекомбинантный вариант

N-концевой части молекулы (rBPI23) почти в 50 раз активнее БПУ-белка в отношении гладких штаммов (Ooi et al., 1991), что связано, по-видимому, с облегченным доступом меньшего по размерам рекомбинантного фрагмента к местам инициального связывания с ЛПС молекулами. Белок воздействует на широкий спектр видов грамотрицательных бактерий, включая как инкапсулированные, так и не содержащие капсул микроорганизмы. Чувствительность бактерий к белку в значительной степени зависит от структуры их оболочечных липополисахаридов, в особенности их полисахаридной цепочки, длинные цепи снижают сродство БПУ-белка к ЛПС вследствие затруднения доступа к коровой анионной области молекулы эндотоксина (рис. 5).

В связи с особой значимостью присутствия ЛПС в оболочке грамотрицательных бактерий в реакции избирательного действия БПУ-белка на эту группу микроорганизмов следует кратко рассмотреть современное представление о структуре эндотоксинов (Raetz, 1990; Rietschel, Brade, 1992; Morrison et al., 1994). Липополисахарид (эндотоксин) наружной мембраны является «визитной карточкой» грамотрицательных бактерий. В составе клеточной стенки бактерий он вместе с белками и липидами формирует надмолекулярный комплекс, известный как О-антиген. Липополисахарид состоит из связанных амидной связью полисахарида и липида А. Полисахаридная часть ЛПС ориентирована на поверхность микробной клетки и в значительной степени определяет серологическую специфичность О-антигена.

Полисахарид в свою очередь состоит из антигенной боковой цепи, представляющей собой полимер из различных сочетаний абеквозы, маннозы, рамнозы, галактозы и глюкозы, которая, как правило, выступает над поверхностью клеточной оболочки (рис. 4, 5) и сердцевинной (коровой) части, которая в качестве основных структурных компонентов содержит несколько молекул 2-кето-З-дезоксиоктоновой кислоты (сокращенно КДО), гексозы, этаноламин и фосфорную кислоту. Три остатка КДО образуют структурный блок, связывающий двухвалентные катионы Mg и Са. Комплекс КДО с катионами определяет в значительной степени некоторые структурнофункциональные свойства внешнего слоя наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Удаление катионов с помощью таких хелатообразующих агентов как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) приводит к разрыхлению наружной мембраны, освобождению (солюбилизации) из нее части молекул липополисахарида и изменению ее барьерных функций. В норме не проницаемая для гидрофобных соединений, в подобных условиях она начинает пропускать их внутрь клеточной стенки. Сердцевинный полисахарид ковалентно связан с липидом А, локализованном во внешнем слое наружной мембраны. Таким образом структура наружной мембраны асимметрична, поскольку липополисахарид локализован исключительно в ее внешнем слое.

Липополисахариды (эндотоксины) в свободном состоянии являются биологически активными соединениями, определяющими многие нежелательные стороны патогенеза инфекционных заболеваний, вызываемых грамотрицательными бактериями. В частности, при взаимодействии с клетками иммунной системы организма-хозяина они вызывают избыточную продукцию химически реактивных производных кислорода нейтрофильными гранулоцитами и цитокинов (ИЛ-1, ФНОа и др.) моноцитами/ма- крофагами. В высоких концентрациях эти соединения могут приводить вместо защиты от инфекции к системному воспалению и инициировать повреждения наиболее важных жизнеобеспечивающих систем макроорганизма. Совокупность этих патологических проявлений известна в литературе и медицинской практике как эндотоксический шок, и борьба с этим синдромом представляет важную клиническую проблему (Watson et al., 1994).

В связи с этим способность БПУ-белка избирательно взаимодействовать и нейтрализовать ЛПС может служить основанием для его использования в медицинской практике. Уже в течение ряда лет ведутся работы в Нью-Йоркском Университете (Elsbach, Weiss, 1993а, 1993b) и калифорнийской фармацевтической фирмой «Хота» по разработке эффективного антиэндотоксического препарата на основе БПУ-белка. Было установлено, что не только природный БПУ-белок (пВР155), но и рекомбинантная форма его N-концевой части (гВР123), полученная биотехнологическим способом, обладают высоким сродством (К = 2—5 пМ) к изолированным липополисахаридам многих грамотрицательных бактерий (Gazzano-Santoro et al., 1992), как в условиях in vitro, так и в цельной крови (Ooi et al., 1991), что является очень важным с медицинской точки зрения. При этом имеет место блокада способности ЛПС запускать ряд реактивных процессов в клетках иммунной системы, в том числе и освобождение цитокинов. На уровне организма подобный эффект обеспечивает его защиту от летальной дозы ЛПС (Elsbach, Weiss, 1993а, 1993b).

Интересно, что структурно-гомологичный БПУ-белку острофазовый ЛПС-связывающий белок плазмы крови человека (ЛІЇС- связывающий белок, ЛСБ) лишен подобной активности. Он в противоположность БПУ-белку усиливает активность липополисахаридов (Tobias, Ulevitch, 1994) как индукторов провоспалительных факторов.

Сочетание таких важных функциональных свойств у БПУ- белка, как блокада провоспалительного действия ЛПС и прямое бактерицидное действие на грамотрицательную микрофлору, является основанием для его клинического применения. Проведены клинические испытания на добровольцах рекомбинантной формы N-концевого фрагмента БПУ-белка (гВР123 или Neuprex), препарат оказался нетоксичным и лишенным иммуногенности. Кроме того, он эффективно подавлял ЛПС-индуцированную продукцию цитокинов, реактивность нейтрофильных гранулоци- тов и нежелательные проявления в системе гемостаза (Von der Mohlen et al., 1995a, 1995b). В настоящее время осуществляется пробное применение в клинике гВР123 с целью снятия менинго- кокковой эндотоксемии и последствий геморрагической травмы. Необходимо отметить то обстоятельство, что защитные свойства белка и его рекомбинантного N-фрагмента проявляются как внутри, так и вне специализированных клеток, в связи с чем он может рассматриваться как эффективное протективное средство и в парентеральном варианте применения (Ammons et al., 1994).

Последствия электростатического взаимодействия катионного белка с поверхностными областями клеточной оболочки грамотрицательных бактерий могут быть разнонаправленными. Предположительно имеет место конкурентное вытеснение ионов Mg2+ и Са2+ из наружной мембраны. Обычно эти ионы играют важную цементирующую роль в формировании плотного слоя наружной мембраны, обогащенного липополисахаридами, путем образования поперечных солевых мостиков между его отдельными молекулами (Elsbach, Weiss, 1983, 1988; Franklin, Show, 1984). Разрыхление липополисахаридного слоя приводит к обнажению гидрофобных областей наружной мембраны и облегчает, таким образом, проникновение через них липофильных молекул (например, актиномицина Д). Такая последовательность физико-химических взаимодействий белка с внешними структурами микробной клетки соответствует экспериментально установленным фактам.

По-видимому, благоприятствует процессу нарушения проницаемости мембран (Mannion et al., 1990а, 1990b) наличие в составе БПУ-белка структурных участков, обогащенных гидрофобными аминокислотами (в частности, пролином). Подобные белковые домены могут образовывать в липидном бислое мембран сквозные поры, наличие которых приводит к нарушению селективной проницаемости и утечке из клеток жизненно важных элементов и макромолекул. В пользу возможности существования такого характера взаимодействий в ходе поражения микробной клетки говорят данные опытов, в которых в качестве мишеней использовали бактерии с повышенной вязкостью наружной мембраны, отличающиеся от мембран контрольных штаммов увеличенной концентрацией насыщенных жирных кислот (Elsbach, Weiss, 1988). Такие штаммы бактерий проявляли повышенную устойчивость к антимикробному действию БПУ-белка. Следовательно, сочетание в структуре рассматриваемого белка свойств поликатионной и гидрофобной молекул делает его высокоэффективным

мембранонарушающим агентом, функционирующим в роли поверхностно-активного вещества. Одним из следствий нарушения структурной целостности оболочки бактерий является активация в ней аутолитических процессов ведущих к последующему распаду фосфолипидов мембран и пептидогликанового скелета.

Заключительная (необратимая) стадия действия БПУ-белка сопряжена со структурной дезорганизацией внутренней (цитоплазматической) мембраны (Mannion et al., 19906) и блокадой в ней транспортных и энергетических процессов.

Активность БПУ-белка в инактивации нейтрофильными гранулоцитами млекопитающих грамотрицательных бактерий усиливается еще рядом белково-пептидных соединений, выявленных в фагоцитах. В псевдоэозинофилах кролика обнаружены два структурно-родственных белка с молекулярной массой около 15 кДа (Ooi et al., 1993; Levy et al., 1993). Ни один из этих белков не проявляет антибактериальных свойств, однако одна из изоформ усиливает в несколько раз эффекты ранней обратимой фазы воздействия БПУ-белка на бактерии. В то же самое время они подавляют ростоингибирующую активность БПУ-белка. Оба белка проявляют ЛПС-связывающую способность и структурно гомологичны белкам САР-18 кролика и кателину из лейкоцитов свиньи (рис. 17). Наряду с этим выявлен синергизм антимикробного действия БПУ-белка человека с катепсином G и эластазой (Olsson et al., 1978) и дефенсинами (Levy et al., 1994).

Кооперативные взаимоотношения БПУ-белка с другими факторами антимикробной защиты, по-видимому, не ограничиваются только белками лейкоцитарного происхождения. В частности, он избирательно активирует фосфолипазы бактериальной оболочки Е. coli (Wright et al., 1990а), что приводит к взаимоусиливающему антимикробному действию белков. Фосфолипазы А2 из нейтрофилов (Wright et al., 1990b), сыворотки (Growl et al., 1991) и очагов воспаления также усиливают дозозависимым образом антимикробную активность БПУ-белка. Кроме того, переход от первой (обратимой) фазы ко второй (необратимой) заметно ускоряется в присутствии терминальных компонентов комплемента (Mannion et al., 1990b), что может рассматриваться в качестве примера кооперации различных молекулярных факторов врожденного иммунитета.

<< | >>
Источник: Кокряков В. Н.. Очерки о врожденном иммунитете. — СПб.: Наука,2006.—261 с.. 2006

Еще по теме Бактерицидный проницаемость увеличивающий белок:

  1. Противоаритмические средства 1В-класса, снижающие проницаемость мембран для ионов натрия и увеличивающие для ионов калия
  2. Белок
  3. Белок
  4. БЕЛОК БЕНС-ДЖОНСА
  5. БЕЛОК
  6. Увеличиваем количество молока
  7. Увеличиваем количество молока
  8. БЕЛОК. Функция
  9. Серия 18. Сложность поз постепенно увеличивается
  10. ПРОПЕРДИН
  11. На эндокринную систему.
  12. АНТИБИОТИКИ
  13. Противоаритмические средства /I/ класса — ингибиторы реполяризации
  14. ЛЕЙКЙНЫ
  15. АНГИОПРОТЕКТОРЫ И КОРРЕКТОРЫ МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ
  16. Мытье перед операцией
  17. Мытье перед операцией
  18. ГИАЛУРОНИДАЗА
  19. ХИНОКСАЛИНЫ