<<
>>

ПЦР в реальном времени

Широко распространенным методом детекции известных мутаций является метод ПЦР в реальном времени. Чаще всего используют так называемое резонансное тушение флюоресценции в TaqMan системе, позволяющее контролировать кинетику ПЦР амплификации непосредс­твенно в ходе реакции [89, 467, 486].

Для детекции мутаций используют зонды, несущие на 5’ и 3’ концах соответственно различные флюорофоры (светители) и их «тушители» (quencher), которые, находясь рядом, подав­ляют флюоресценцию (рис. 4.5). При этом зонды должны быть компле­ментарны последовательности аплифицируемой ДНК и отличаться лишь одним нуклеотидом, характерным для одного и другого аллеля. Зонд, содержащий на 3’ конце краситель FAM, полностью комплементарен

Homozydotus for Allele A Гомозигота по аллелю А

Homozydotus for Allele В Гомозигота по аллелю В

Heterozygotus for Allele A + В Гетерозигота по аллелям А + В

Рис. 4.5.

Определение аллельного полиморфизма с помощью 5’-нуклеазного (TaqMan) анализа (пояснения в тексте)

аллелю 1 и при гибридизации дает устойчивый дуплекс.

При гибриди­зации этого зонда с аллелем 2 будет происходить неполное спаривание нуклеотидов и возникает так называемый «мисматч» (mismatch). Соот­ветственно зонд, имеющий метку ТЕТ, полностью комплементарен алле­лю 2, но при гибридизации с аллелем 1 не дает устойчивого дуплекса.

Непосредственно перед реакцией в ПЦР-смесь добавляют зонды, которые гибридизуются с комплементарными им последовательностя­ми ДНК. В случае гетерозиготы по исследуемым аллелям гибридизу- ются оба зонда.

Достраивая комплементарную последовательность ДНК, Taq-по­лимераза за счет своей экзонуклеазной активности разрушает только устойчивые дуплексы. При этом происходит отщепление соответству­ющего флюорофора, который переходит в раствор и, не находясь под влиянием «тушителя», дает свой флюоресцентный сигнал. В зависи­мости от сигнала свечения можно судить каким аллелем (аллелями) представлен данный образец ДНК. Интенсивность сигнала флюорес­ценции зависит от числа циклов ПЦР. Размер амплифицируемого фраг­мента ДНК обычно не превышает 150 нуклеотидов, что серьезно огра­ничивает применение этого метода. Вмсте с тем прохождение реакции можно контролировать в реальном времени, что является его главным преимуществом. Для того, чтобы диагностировать наличие мутации, иногда достаточно провести менее 25 циклов амплификации.

<< | >>
Источник: БарановВ.С.. Генетический паспорт — основа индивидуальной и предик­тивной медицины / Под ред. В. С. Баранова. — СПб.: Изд-во Н-Л,2009. — 528 с.: ил.. 2009

Еще по теме ПЦР в реальном времени:

  1. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
  2. Альтернативные ПЦР-методы амплификации нуклеиновых кислот
  3. Временная электрокардиостимуляция Показания к проведению временной электрокардиостимуляции (ЭКС)
  4. Реальные и виртуальные сны
  5. ВОЗДЕЙСТВИЕ НЕПОСРЕДСТВЕННО НА ВНУТРЕННИЕ ОРГАНЫ - ПУТЬ, РЕАЛЬНО ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ БОЛЬНЫМИ, НО НЕ ЗДОРОВЫМИ ЛЮДЬМИ.
  6. 2. Современная наука пока не подтверждает мнение о реальном существовании меридианов. Причина возникновения меридианов в древней китайской иглотерапии
  7. НЕ ХВАТАЕТ ВРЕМЕНИ НА ВОСПИТАНИЕ
  8. Закон Времени
  9. Управление временем
  10. 28. Выбор времени
  11. Выздоровление требует времени
  12. ВЫЗОВЫ ВРЕМЕНИ
  13. Влияние времен года
  14. О естествах времен года
  15. ВРЕМЕННАЯ ОСТАНОВКА КРОВОТЕЧЕНИЯ
  16. О влиянии времен года .и их изменениях
  17. 2.10. СКОЛЬКО ВРЕМЕНИ СЛЕДУЕТ ГОЛОДАТЬ!