ПЦР в реальном времени

Широко распространенным методом детекции известных мутаций является метод ПЦР в реальном времени. Чаще всего используют так называемое резонансное тушение флюоресценции в TaqMan системе, позволяющее контролировать кинетику ПЦР амплификации непосредс­твенно в ходе реакции [89, 467, 486].

Homozydotus for Allele A Гомозигота по аллелю А

Homozydotus for Allele В Гомозигота по аллелю В

Heterozygotus for Allele A + В Гетерозигота по аллелям А + В

Рис. 4.5.

аллелю 1 и при гибридизации дает устойчивый дуплекс.

Непосредственно перед реакцией в ПЦР-смесь добавляют зонды, которые гибридизуются с комплементарными им последовательностя­ми ДНК. В случае гетерозиготы по исследуемым аллелям гибридизу- ются оба зонда.

Достраивая комплементарную последовательность ДНК, Taq-по­лимераза за счет своей экзонуклеазной активности разрушает только устойчивые дуплексы. При этом происходит отщепление соответству­ющего флюорофора, который переходит в раствор и, не находясь под влиянием «тушителя», дает свой флюоресцентный сигнал. В зависи­мости от сигнала свечения можно судить каким аллелем (аллелями) представлен данный образец ДНК. Интенсивность сигнала флюорес­ценции зависит от числа циклов ПЦР. Размер амплифицируемого фраг­мента ДНК обычно не превышает 150 нуклеотидов, что серьезно огра­ничивает применение этого метода. Вмсте с тем прохождение реакции можно контролировать в реальном времени, что является его главным преимуществом. Для того, чтобы диагностировать наличие мутации, иногда достаточно провести менее 25 циклов амплификации.