<<
>>

Методы ДНК-чипов

Важной инновацией молекулярной биологии стала технология биологических микрочипов. Эта технология позволяет использовать сравнительно небольшие количества исходного материала, проводить реакцию в микрообъемах, одновременно осуществлять многопара­метрический анализ множества генов одного и того же объекта.

Ее чувствительность сопоставима со стандартными амплификационны- ми методами ДНК-диагностики и в некоторых случаях превосходит их [137, 350, 543, 601].

В зависимости от природы иммобилизованных зондов различают 4 основные типа биочипов:

• ДНК-чипы;

• РНК-чипы;

• белковые микрочипы;

• клеточные микрочипы.

Наибольшее распространение в исследовательской и клиничес­кой практике, особенно для анализа спектра различных мутаций или

аллельных вариантов разных генов, получили ДНК-чипы. В типичном варианте они представляют собой миниатюрные гелевые пластинки с многочисленными углублениями, ячейками, содержащими набор ДНК-зондов (рис.

4.10), расположенными на стекле или мембране. За последние десять лет технология микрочипов превратилась в бурно развивающееся прикладное направление биологической науки: де­сятки фирм разрабатывают и предлагают биологические микрочипы, содержащие массивы от нескольких десятков до сотен тысяч и более ДНК-зондов [573]. С помощью биочипов можно также анализировать и такие изменения ДНК, как транслокации, дупликации, протяжен­ные делеции, а также микродупликации и микроделеции [14, 84, 150, 194, 356, 702, 802].

Технологии изготовления ДНК-чипов различаются размером нано­симых фрагментов ДНК, методами иммобилизации, процедурами гибри­дизации и системами детекции [466, 573]. По конечному этапу детекции микрочипы бывают двух типов: гибридизационные и ферментативные.

Гибридизационные чипы в зависимости от способа считывания сигнала подразделяются на электронные (фирма “Nanogen”) и флюоресцентные (фирмы “Affymetrix”, “Illumina”, «Биочип») и т. д. [Биочип: www.biochip. ru; Affymetrix: www.affymetrix.com; Applied Biosystems: www.europe. appliedbiosystems.com; Asper Biotech: www.asperbio.com; Illumina: www. illumina.com; Nanogen: www.nanogen.com].

При этом дискриминация мутаций может происходить как до гибридизации, то есть еще в процессе подготовки пробы (чипы фирм “Applied Biosystems”, “Affymetrix”), так и в процессе гибридизации (фирма «Биочип»). Для примера проиллюстрируем гибридизацион-

Рис.

4.11. Метод анализа мутаций на основе аллель-специфичной гибридизации, разработанный в ИМБ РАН (пояснения в тексте)

ные методы анализа мутаций, используемые фирмами «Биочип» (1) и «АГ!уте1;пх» (2).

1. Предложенная и разработанная в России технология микрочипов (Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН) предпо­лагает предварительную мультиплексную амплификацию исследуемых фрагментов ДНК с использованием флюоресцентно меченных прайме­ров (или дезоксинуклеотидтрифосфатов) [543, 648, 770]. В результате добавления избытка одного из праймеров и проведения 2 раундов реп­ликации достигается образование большого количества преимуществен­но меченого одноцепочечного продукта. Последний наносят на биочип, где он гибридизуется с иммобилизованными в геле олигонуклеотидны­ми зондами (рис. 4.11). Если последовательность анализируемой ДНК полностью комплементарна последовательности ДНК-зонда, образуется стабильный дуплекс, который легко детектируется благодаря флюорес­центной метке. Однако, если искомого фрагмента нет или в нем при­сутствует некомплементарное основание, то стабильный дуплекс не воз­никает (сигнал флюоресценции отсутствует). Данный метод позволяет анализировать до 50 полиморфных вариантов с точностью более 98 %.

2. Для анализа генетического полиморфизма и мутаций, используя технологию “Affymetrix” [www.affymetrix.com], предполагается при-

A. Anneal B. Gap Fill — Polymerization C. Gap Fill — Ligation

D. Exonuclease selection E. Probe release F. Amplification

Рис. 4.12. Метод подготовки проб для анализа однонуклеотидных мутаций фирмы “Affymetrix” (пояснения в тексте)

менение так называемых «специальных проб».

Такие пробы состоят из нескольких фрагментов: Ш и Ж — специфичных для анализируемой последовательности ДНК; P1 и P2 — являющихся универсальными прай­мерами и фланкирующих сайт для фермента клевазы; и 1а£-последователь- ности — специфической метки для выявления определенного при гибридизации на микрочипе (рис. 4.12). Детекция мутаций происходит следующим образом: в исследуемый образец, содержащий одноцепочеч­ную ДНК с искомой мутацией, добавляют «специальную пробу». Проба комплементарно гибридизуется с последовательностью ДНК анализируе­мого образца (фрагментами Н1 и Н2) (рис. 4.12 А). Далее добавляют тер­мостабильную ДНК-полимеразу и четыре разных нуклеозидтрифосфата (используют, соответственно, четыре пробирки). ДНК-полимераза достра­ивает 3’-конец пробы Н1 на одно основание, соответствующее вариабель­ной позиции (рис. 4.12 В). Затем проводят лигазную реакцию, при кото­рой происходит соединение 5’-конца встроенного основания с 3’-концом пробы Н2 (рис. 4.12 С). На следующей стадии (рис. 4.12 Б) экзонуклеаза разрушает оставшуюся ДНК исходного образца. С целью дальнейшей ам­плификации кольцевую молекулу пробы разрезают клевазой (рис. 4.12 Е). Амплификацию проводят с использованием универсальных праймеров Р1 и Р2 (рис. 4.12 F). Далее пробы гибридизуют с микрочипом. Специфич­ность гибридизации достигается за счет специально сконструированного tag-фрагмента, который, наряду с универсальными праймерами, является одним из ноу-хау фирмы “Affymetrix”. Таким образом, в исследуемом об­разце можно однозначно выявлять до 1000 и более SNPs. Точность метода при анализе тысячи SNPs составляет около 90 %.

3. Еще один из перспективных вариантов биочипов для анализа генетического полиморфизма сконструирован на основе метода SBE (single base primer extension — удлинение праймера на одно основа­ние), позволяющего достигать высокой степени дискриминации гиб- ридизационных сигналов на аллелях «мутантного» и «дикого» типов. При подготовке проб предварительно амплифицируют исследуемый фрагмент ДНК, содержащий маркерный SNP, после чего проводят его гибридизацию на биочипе.

Последовательность зонда должна быть комплементарна последовательности исследуемой ДНК, включая его последнее основание на 3’-конце, после которого следует вариабель­ный нуклеотид. Принцип детекции заключается в следующем: после гибридизации зонда с образцом в реакцию добавляют меченные разны­ми красителями дидезоксинуклеотиды и ДНК-полимеразу. Благодаря присутствию дидезоксинуклеотидов возможно присоединение толь­ко одного-единственного нуклеотида к 3’-концу иммобилизованного зонда. После отмывки чипа флюоресценция тестируемой пробы оп­ределяется именно этим меченым дидезоксинуклеотидом. По степени дискриминации между гомозиготными и гетерозиготными генотипами метод SBE в среднем на порядок превосходит гибридизацию с аллель- специфичными зондами [601]. Недостатки этого метода состоят в необ­ходимости синтеза олигонуклеотидов, иммобилизованных на чипе со свободным 3’-концом, что исключает применение метода для наиболее перспективного типа чипов, создаваемых способом фотолитографии.

4. Концептуально близкой технологии SBE являются биочипы, созданные на основе метода APEX (arrayed primer extension — до­стройка праймеров, синтезированных на обеих цепях ДНК). Отличие состоит в том, что при анализе тестируется не одна, а сразу обе цепи ДНК и используются несколько различных иммобилизованных зондов для каждой позиции. Это дает возможность идентифицировать с высо­кой степенью надежности новые мутации и полиморфные сайты. Чипы на основе APEX-технологии разработаны эстонской фирмой «Asper Biotech» [www.asperbio.com], показаны на рисунке 4.13.

5. Несколько вариантов гибридизационных биочипов были разрабо­таны на базе НИИ АГ им. Д. О. Отта СЗО РАМН. С помощью одного из

DNA from Client
PCR with ~20 % dUTP
DNA (PCR product ~100-1000 bp)
UNG and SAP treatment
DNA ~20-25 bp)
\

To Genorama™ QuattroImager

I CcO I

kCAMERAH

14 41 nt,

yellow laser red laser

green laser

blue laser

Рис.
4.13. Мини-секвенирование на микрочипах («Asper Biotech») (пояснения в тексте)

Рис. 4.14. Интерфейс программы «ImageWare» для анализа результатов генотипиро- вания при помощи «фармакогенетического биочипа» (пояснения в тексте)

них — «фармакогенетического биочипа» — можно изучать наследствен­ную предрасположенность к привычной невынашиваемости беременнос­ти и к лейкозам у детей [150, 194]. Биочип позволяет проводить анализ 13 аллельных полиморфных сайтов 7 генов системы детоксикации: CYP1A1 (4887C>A,4889A>G и 6235T>C), CYP2D6 (1934G>A и 2637delA), GSTM1 (делеция), GSTT1 (делеция), NAT2 (481T>C,590A>G и 857A>G), CYP2C9 (430С>Т и 1075C>T) и CYP2C19 (681G>A) и одного (677C>T) гена мети­лентетрагидрофолиевой кислоты — MTHFR. На рисунке 4.14 приведены результаты биочипового анализа с применением специального програм­много обеспечения. «Фармаген-биочип» уже прошел клинические испыта­ния и внедрен в практику лабораторной диагностики нескольких медицин­ских центров РФ. На стадии клинических испытаний находятся биочипы для тестирования наследственной предрасположенности к тромбофилии («ТРОМБО-биочип») и к сердечно-сосудистым заболеваниям («Кардио­биочип») [97]. Ведется работа по созданию биочипов по тестированию ос­новных мутаций в гене ŒTR при муковисцидозе, а также наследственной предрасположенности к бронхиальной астме и остеопорозу.

6. Особого внимания заслуживают биочипы, позволяющие осу­ществлять общегеномный скрининг ассоциаций (Genome Wide As­sociation Studies — GWAS) [www.affymetrix.com и www.illumina.com],

* 4 4

Nsp I Nsp I Nsp I

RE Digestion

в результате которого становится возможной идентификация всех генов-маркеров, геномных локусов и отдельных маркерных SNP, ассоциированных с различными МФЗ (см. гл. 2, 3, 9). С этой целью исследуемый образец ДНК подвергают гидролизу определенными эндонуклеазами, образовавшиеся фрагменты лигируют (сшивают) с адаптерными последовательностями ДНК и амплифицируют с од­ним праймером, специфичным исследуемому фрагменту генома. По­лученные фрагменты ПЦР метят флюоресцентными красителями и гибридизуют с наборами ДНК-зондов, находящихся на биочипе (рис. 4.15). По результатам анализа гибридизационной картины биочипа с помощью специальной компьютерной программы судят о наличии в исследованном образце того или иного набора аллельных вариантов однонуклеотидных замен — SNP (рис. 4.16). Сопоставление частот соответствующих аллелей у больных и здоровых индивидов позволя­ет идентифицировать все SNP и, соответственно, все гены и ДНК-ло- кусы, ассоциированные с конкретной болезнью, то есть выяснить спе­цифический генетический профиль МФЗ. Метод позволяет в одном анализе исследовать до нескольких десятков и сотен тысяч маркеров, однако его точность не превышает 90 %. Поэтому на современном эта-

пе данный метод следует рассматривать скорее как поисковый, но не диагностический. В настоящее время метод с успехом применяется для полногеномного скрининга ассоциаций различных МФЗ, включая диабет тип 1 и тип 2, коронарную болезнь, бронхиальную астму, бо­лезнь Крона, маниакально-депрессивный психоз и др. (см. разделы 1, 6.1, 6.3, 9).

7. Существенным продвижением в повышении эффективности, точности и стоимости тестирования мутаций явились разработки последних двух лет, направленные на совмещение несомненных пре­имуществ метода ПЦР в реальном времени с принципами биочиповой диагностики (рис. 4.17). Так, с помощью биочипа фирмы “Fluidigm” [www.fluidigm.com] можно одновременно анализировать мутации или тестировать SNP в 9216 локусах. Метод имеет большую специ­фичность и точность, чем метод полногеномного скрининга GWAS (см. раздел 4.6.). Себестоимость исследования одной мутации/поли- морфизма не превышает 1 рубля.

3 BioMark* Dynamic Array for Genotype Profiling - Microsoft Internet Explorer

The Dynamic Array Solution

The BioMark Dynamic Array is a highly efficient solution for mi multiplex genotyping using TaqMan® PCR assays. The key to efficiency is the matrix of channels, chambers, and valves that the work of assembling assays. There are currently two types dynamic arrays ottered for genotyping applications

99% assay conversion rate from 384-well system

48.48 Dynamic Airay

48 samples and 48 assays are I and pressure-loaded into 2,3041 96 steps to test 48 SNP's again

Use your existing TaqMan assays: 99% assay conversion rate from 384-well system

ng TaqMar® SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems)

Рис. 4.18. Оборудование, необходимое для масс-спектрометрического анализа

(http://biophysics.uoguelph.ca/central/facilities.htm) (пояснения в тексте)

Микросферы покрыты захватывающими реагентами (олигонуклеотидами или антителами)

Образец добавляют к микросферам, аналит связывается с микросферами

Рис. 4.19. Гибридизация на микросферах (www.perkinelmer.com) (пояснения в тексте)

<< | >>
Источник: БарановВ.С.. Генетический паспорт — основа индивидуальной и предик­тивной медицины / Под ред. В. С. Баранова. — СПб.: Изд-во Н-Л,2009. — 528 с.: ил.. 2009

Еще по теме Методы ДНК-чипов:

  1. (G11.3) Мозжечковая атаксия с нарушением репарации ДНК
  2. D.N.A. (DEOXY-RIBONUCLEIC ACID) - ДНК (ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА)
  3. Традиційні методи контрацепції. Бар’єрні методи контрацепції
  4. Альтернативные ПЦР-методы амплификации нуклеиновых кислот
  5. Методи підготовки вагітних до родів. Медикаментозні методи підготовки вагітних до родів
  6. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ МЕТОДОМ МИКРОЧИПОВ
  7. Разрабатываемые методы
  8. Функциональные методы
  9. Другие методы лечения
  10. Распространенные методы исследований
  11. Биологические методы
  12. Биологические методы
  13. Метод действия гомеопатии
  14. Определение перфорина методом ELISPOT