<<
>>

БАЗОВЫЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МУТАЦИЙ

Одним из основных и исторически первым методом идентифика­ции мутаций был метод блот-гибридизации (Саузерн-блот), пред­ложенный еще в 1975 году английским ученым Эдвардом Саузерном [731].

В течение почти 10 лет этот способ оставался единственным на­дежным методом детекции мутаций разных генов. Суть метода состоит в рестрикции геномной ДНК одной или несколькими эндонуклеазами с последующим разделением образовавшихся фрагментов ДНК по их молекулярной массе путем электрофореза в агарозном геле. Затем про­водится блоттинг: фрагменты ДНК переносят на плотный носитель (целлюлозный фильтр или нейлоновую мембрану). Фиксированную на фильтрах ДНК гибридизуют с мечеными ДНК-зондами, позволяющими точно определить локализацию и, соответственно, размеры искомого геномного фрагмента ДНК. Необходимость работы с чистыми препа­ратами ДНК, применение радиоактивно меченых зондов, длительность и трудоемкость процедуры делают метод неудобным и дорогостоящим для практического использования. Тем не менее и в настоящее время различные варианты данного метода все еще находят применение в на­учных и диагностических целях.
Прежде всего, это относится к гибри­дизации ДНК-зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК (Нозерн-блот), а также электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах, с мечеными антителами (Вестерн-блот).

В настоящее время метод Саузерн-блот применяется для иденти­фикации протяженных мутаций, затрагивающих структуру гена (боль­шие делеции, инсерции, дупликации). Наличие протяженных делеций, инсерций, дупликаций, а также точечных мутаций в сайтах рестрикции приводит к изменениям размеров рестрикционных фрагментов [86].

В отличие от метода блот-гибридизации, не представляющего инте­реса для тестирования генетического полиморфизма, метод полимераз­ной цепной реакции (ПЦР), предложенный в 1983 году, с полным правом можно рассматривать как базовый метод современной ДНК-диагностики.

Применение ПЦР в течение часа приводит к увеличению в миллионы раз количества заданного фрагмента геномной ДНК, что существенно облег­чает идентификацию искомой мутации или полиморфизма.

Принципиальная схема ПЦР показана на рисунке 4.1.

Реакция проводится в несколько последовательных этапов, для реализации которых широко используются специальные програм­мируемые аппараты — термоциклеры, позволяющие задавать и поддерживать определенный температурный режим реакции. Все компоненты реакции — матричную ДНК, олигопраймеры, смесь де- зоксинуклеотидов и термофильную ДНК-полимеразу — добавляют в специальный солевой буфер непосредственно перед помещением пробирки с реакционной смесью в термоциклер.

На первом этапе исследуемая двухнитевая матричная ДНК перево­дится в однонитевую форму путем ее нагревания в течение нескольких минут до температуры 94-98 °С. Дальнейшая схема заключается в чередовании циклов:

фрагмент ДНК — объект амплификации

І I

ІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІ

• гибридизация или отжиг ДНК с праймерами;

• синтез последовательностей, комплементарных матричной ДНК;

• денатурация образовавшихся двухнитевых структур.

На этапе гибридизации температура реакционной смеси снижается до +50-65 °С. Находящиеся в растворе олигопраймеры гибридизуют- ся с денатурированной (одноцепочечной) геномной ДНК, содержащей комплементарные (соответствующие им) участки.

Повышение температуры до +65-72 °С, оптимальной для работы термофильной Taq1 ДНК-полимеразы, запускает синтез ДНК в на­правлении от 5’ к З’-концу геномной ДНК-матрицы. При дальнейшем повышении температуры до +80-90 °С синтез ДНК прекращается, происходит денатурация с освобождением с геномной матрицы уже синтезированных фрагментов ДНК, которые, в свою очередь, становятся матрицами для синтеза ДНК при последующих циклах амплификации.

Таким образом, в каждом цикле происходит увеличение числа синтезированных копий участка амплификации, причем содержание продуктов амплификации нарастает в геометрической прогрессии. В среднем один полный цикл денатурация — гибридизация — син­тез — денатурация длится одну-три минуты. За 25-30 циклов число синтезированных копий ДНК достигает нескольких миллионов. Выбор оптимального режима работы определяется длиной и специфичностью амплифицируемого участка.

При помощи ПЦР можно идентифицировать многие мутации, а также изучать полиморфные сайты. Подбор олигопраймеров проводят на основании анализа нуклеотидных последовательностей в участках ДНК, фланкирующих ту или иную мутацию. Разработаны различные варианты автоматического выбора олигопраймеров, оптимальных для получения различных амплификатов (программы «О^о 6», «Рпше-З» и другие).

Подбор праймеров целесообразно проводить согласно следующим критериям:

• отсутствие внутренней вторичной структуры;

• сбалансированный состав и равномерное распределение G/C и А/Т пар по всей последовательности;

• отсутствие комплементарности между З'-концами (из-за существо­вания опасности образования димеров праймеров);

• наличие единой температуры плавления (разброс температур плав­ления праймеров не более 1 °С от среднего значения);

Рис.

4.2. Интерфейс программы «Oligo 6» (этап анализа, направленного на поиск наличия/отсутствия димеров между праймерами) (пояснения в тексте)

• отсутствие комплементарности последовательностей праймеров с последовательностями других генов в геноме человека.

На рисунке 4.2 приведен интерфейс программы «Oligo 6», используе­мой при подборе праймеров первого раунда для гена MTHFR. Этап анали­за по выявлению наличия/отсутствия димеров между праймерами Ц и R).

В ряде случаев, особенно при идентификации разных мутаций в одном гене, проводят одновременную амплификацию нескольких участков матричной ДНК. Такую модификацию метода называют мультиплексной ПЦР. Она широко используется для идентификации мутаций в гене CFTR (муковисцидоз), в гене дистрофина (миодистро- фия Дюшенна), при поиске аллельных ассоциаций в случае МФЗ.

Анализ результатов ПЦР проводят путем гель-электрофореза про­дуктов амплификации, которые при необходимости обрабатывают со­ответствующими эндонуклеазами. В дальнейшем гели окрашивают красителем этидием бромидом и визуализируют продукты ПЦР (рест­рикции) в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 380 нм. Кроме того, продукты амплификации можно идентифицировать путем

блот-гибридизации со специфическими ДНК-зондами или другими методами окрашивания.

Подробно с техникой постановки ПЦР, ее многочисленными модификациями, а также с методами анализа ДНК, основанными на применении ПЦР, можно ознакомиться в следующих монографиях и методических руководствах [86, 87, 103, 211]. Некоторые из этих методов кратко рассмотрены в следующих разделах данной главы.

Следует отметить, что ПЦР, безусловно, самый часто используе­мый молекулярный метод, позволяющий не только идентифицировать многие уже известные мутации, но и лежащий в основе более сложных современных методов изучения генома, например метода чиповой диагностики (см. ниже).

<< | >>
Источник: БарановВ.С.. Генетический паспорт — основа индивидуальной и предик­тивной медицины / Под ред. В. С. Баранова. — СПб.: Изд-во Н-Л,2009. — 528 с.: ил.. 2009

Еще по теме БАЗОВЫЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МУТАЦИЙ:

  1. РЕАЛИЗАЦИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ
  2. МУТАЦИЯ
  3. Базовые категории маркетинга: нужда, потребность, спрос
  4. БАЗОВЫЕ КОНЦЕПЦИИ ПРИНЯТИЯ УПРАВЛЕНЧЕСКИХ РЕШЕНИЙ
  5. Обзор тренировок 1-го уровня (базовая методика Норбекова—Хвана)
  6. Базовая модель и конкретные формальные модели
  7. Традиційні методи контрацепції. Бар’єрні методи контрацепції
  8. Методи підготовки вагітних до родів. Медикаментозні методи підготовки вагітних до родів
  9. Разрабатываемые методы
  10. Функциональные методы
  11. Другие методы лечения
  12. Распространенные методы исследований
  13. Биологические методы
  14. Биологические методы
  15. Метод действия гомеопатии
  16. Определение перфорина методом ELISPOT
  17. 3. НОВЫЕ МЕТОДЫ УСТАНОВЛЕНИЯ СОТРУДНИЧЕСТВА
  18. МЕТОДЫ КОНТРАЦЕПЦИИ